一文帶你讀懂蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)的五種方法

蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)是一款智能化的氮與蛋白質(zhì)含量分析儀器，采用內(nèi)置計算機(jī)控制，自動化完成蒸餾過程，大屏觸摸設(shè)置參數(shù)，只需輕輕推至取放硝化管把手，安全把手硝化管置于工作部位，關(guān)閉亞克力安全門，自動完成加水、加堿與蒸餾，工作完成后自動關(guān)機(jī)并鳴音提示。

蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)主要有五種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法和酚試劑法

1.凱氏定氮法：

蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,留在消化液中,然后加堿蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù),即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外,還含有其它含氮物質(zhì),所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。

2.雙縮脲定氮法：

在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有:硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

3.紫外吸收定氮法：

蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。形成顏色產(chǎn)物的量取決于蛋白質(zhì)的濃度。實際測定時,必須預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作一個標(biāo)準(zhǔn)校正曲線,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液加入雙縮脲試劑后,反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物用紫外-可見分光光度計在540nm 波長下測定吸光度,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對照。然后將測得的值分別對蛋白濃度(mg/ ml) 作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據(jù)測得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行紫外吸收法測定時,由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。

4.酚試劑法：

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin —酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是:

①在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。

②Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。